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流式细胞检测实验

更新时间:2020-04-13

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简要描述:

流式细胞检测实验工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。大致分为流式细胞术、细胞周期检测、细胞增殖检测、细胞因子检测等。

流式检测分类

1、流式细胞术(FlowCytometry,FCM):
   就是对在高速流动的鞘液包裹下的细胞、粒子进行分析和分选的技术,这种细胞或粒子是经过特异荧光标记的。其特点是测量速度快,每秒钟能测数千个乃至上万个细胞,且可进行多参数测量,另一特点是在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来,这就是分选技术。
   重要参数:前向角散射(FSC):前向角散射光的强度与细胞的大小有关,也就是说,同一个细胞群体,FSC强的,其细胞大一些,而FSC弱的,其细胞小一些。侧向角散射(SSC):侧向角散射又称90°散射或大角散射。侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感,对胞内较大的颗粒也会有反应。所以,侧向角散射光的强弱可反应细胞内精细结构和颗粒的性质。荧光信号(FL):是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光,不同的荧光染料其发射波长不同。通过荧光强度可将同一个细胞群体中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分开来,也就是我们通常所说的阳性细胞,也可以将阳性细胞中的高FL的细胞与低FL的细胞区分开来,也就是可以把强阳性细胞和弱阳性细胞区分开来。一般的流式细胞仪只装有一个激光光源(488nm),可测出三个FL,即FL1、FL2、FL3。FL2-W指检测荧光的脉冲宽度,区分单个细胞和双联体细胞FL2-H指脉冲高度,细胞单位面积上的荧光浓度FL2-A指脉冲面积,即细胞荧光总和。

 

2、细胞周期检测:
    细胞内的DNA含量随着细胞周期进程发生周期性变化。利用PI标记的方法,通过流式细胞仪对细胞内DNA的相对含量进行测定,可分析细胞周期各时相的百分比,反映细胞的增殖状态和非二倍体(异倍体)的DNA含量。其中PI即碘化丙锭,可以与细胞内DNA和RNA结合,采用RNA抑制剂将RNA消化后,通过流式细胞术检测与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。

 

3、细胞增殖检测
    示踪染料标记法:示踪染料能与细胞发生非特异性的稳定结合,主要有两种结合方式:进入胞内与蛋白质共价结合,如CFSE和BRSE;嵌入细胞膜的磷脂双分子层,与细胞非公价结合,如PKH类和CellVue类等。CFSE是活细胞染料,又称 CFDA-SE或 CFDA,其标记细胞后对细胞毒性小,被激发后能发出很强荧光,且非常稳定,只有当细胞分裂时,母细胞内的染料会被平均分配到子细胞中,细胞的荧光信号减少一半,细胞分裂代数越多,信号降低程度越大。

 

4、细胞因子检测
    细胞因子是一类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应等功能的蛋白或小分子多肽。根据功能可分为六大类:白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、生长因子和趋化因子。胞内细胞因子:胞内染色法( intracellularstaining assay);胞间细胞因子:CBA法(cytometric bead assay,流式微球阵列)。其优点为单细胞水平,可多参数检测。

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