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细胞周期检测服务

简要描述:

细胞.周期分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期:即DNA合成前期( G1期)、DNA合成期( S期)与DNA合成后期(G2期)。某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期,停止细胞分裂,执行-定生物学功能 ( G0期)。由于细胞周期各时相的DNA含里不同,通常正常细胞的G1/ G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而G2/ M期具有四倍体细胞的DNA含里(4N) ,而S期的DNA含里介于二倍体

更新时间:2021-04-07

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实验共分以下4个主要步骤:

1.细胞铺盘

HeLa S3细胞,密度为80%左右分盘,使铺盘密度在50%左右, 为满足流式细胞仪上机要求,细胞数目需大于1x10组。2.细胞同步化处理:

a)加入终浓度2mM的Thymidine同步化18h

b)用温育的PBS洗4次,更换新鲜培养基,培养9h

c)再加入2mM Thymidine再次同步化18h后

3.样品收集;

a)分别收取释放2h(S期),6h(G2/M期)和12h(G1期)細胞样品

b)每个样品收取都使用预冷的PBS洗涤4次,1000g离心5min, 弃上清

c) 100uL PBS重悬沉淀,吸取出细胞悬液于移液器中,于移去细胞的管中加入900μl预冷的70%乙醇,旋涡振荡器震荡中滴入细胞悬液。

d) 4C固定一小时或更 长时间。

e) 1500rmp,离心10min,去固定液。

f)细胞染色液配制: 50xRNase A母液: 50xPI母液: PBS=20: 20: 960; RNase A母液浓度1mg/mL,工作浓度20μg/mL; PI母液浓度2.5mg/mL, 工作浓度50μg/mL 。

g)细胞37度染色1h。根据细胞童,加入一定体积的细胞染色液(1~1.5mL) 重悬,使上机时细胞通过率为

200~350Cl/s,,染色液不可过多或过少,过多则细胞密度过低上机速度严重不足,过少则导致细胞粘结。

h) 300目筛网过滤至流式管中。

4.上机检测;

流式细胞仪上机检测,计数50000个细胞。

5.同步化数据分析

数据使用ModFit软件分析。

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